載玻片是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及材料科學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的工具之一，其使用規(guī)范直接影響樣本制備質(zhì)量、觀察效果及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。以下從載玻片的選擇、清潔、樣本處理、封片技術(shù)、染色與固定、標(biāo)記與保存等環(huán)節(jié)，系統(tǒng)闡述其使用細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng)。

　　一、載玻片的選擇與預(yù)處理

　　1. 材質(zhì)與類型

　　- 普通載玻片：用于常規(guī)組織、細(xì)胞或微生物觀察，厚度通常為1-1.2mm，需滿足透光性要求。

　　- 磨砂邊載玻片：邊緣磨砂處理，便于書(shū)寫標(biāo)記，避免滑脫。

　　- 帶凹槽載玻片：用于液體樣本(如血液、細(xì)菌懸液)，可防止樣本流動(dòng)。

　　- 熒光專用載玻片：低熒光背景，適用于熒光顯微觀察。

　　2. 清潔與滅菌

　　- 新載玻片處理：出廠時(shí)可能殘留油脂或灰塵，需用70%乙醇擦拭，再以超純水沖洗，烘箱干燥(60℃, 30分鐘)。

　　- 重復(fù)使用載玻片：先用洗衣粉水煮沸去除蛋白殘留，清水沖洗后浸泡于鉻酸洗液(需戴防護(hù)手套)過(guò)夜，取出后流水沖洗12小時(shí)，烘干備用。

　　- 滅菌處理：高溫高壓滅菌(121℃, 20分鐘)或紫外線照射30分鐘，避免微生物污染。

　　二、樣本加載與固定

　　1. 樣本類型與加載方式

　　- 液體樣本(如血液、細(xì)菌懸液)：

　　- 滴加少量樣本(直徑約5mm)于載玻片中央，避免過(guò)量導(dǎo)致溢出。

　　- 血液樣本需推片制備血涂片：取一滴血置于一端，以另一載玻片邊緣快速推平，形成均勻薄層。

　　- 固體樣本(如組織切片、菌落)：

　　- 用鑷子夾取樣本，輕放于載玻片中央，最小化機(jī)械損傷。

　　- 培養(yǎng)細(xì)胞：

　　- 棄去培養(yǎng)基，用PBS輕洗后，胰酶消化收集細(xì)胞，滴加懸浮液并自然沉降。

　　2. 固定方法

　　- 空氣干燥法：適用于血液、糞便樣本，室溫靜置至干燥。

　　- 化學(xué)固定法：常用甲醇、乙醇或丙酮固定5-10分鐘，用于細(xì)胞形態(tài)固定。

　　- 加熱固定法：火焰灼燒載玻片背面(需遠(yuǎn)離樣本)，快速通過(guò)以固定細(xì)菌涂片。

　　三、封片技術(shù)與蓋玻片使用

　　1. 封片劑選擇

　　- 水溶性封片劑：甘油、PBS(用于活細(xì)胞觀察)。

　　- 非水溶性封片劑：中性樹(shù)膠(如DPX)、指甲油(用于封片)。

　　- 熒光封片劑：抗熒光淬滅劑(如ProLong Gold)。

　　2. 蓋玻片操作規(guī)范

　　- 傾斜接觸法：以45°角緩慢放下蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。

　　- 封片劑用量：液體樣本需覆蓋樣本且不超過(guò)蓋玻片1/3面積；過(guò)量會(huì)導(dǎo)致溢出或樣本漂移。

　　- 排除氣泡：輕壓蓋玻片邊緣，用濾紙吸除多余液體，或用鑷子輕敲載玻片排出氣泡。

　　四、染色與標(biāo)記

　　1. 染色步驟

　　- 單一染色法(如亞甲藍(lán)、結(jié)晶紫)：滴加染液覆蓋樣本，染色30秒-2分鐘，水洗后吸干。

　　- 復(fù)合染色法(如革蘭氏染色)：需嚴(yán)格按順序操作(初染→媒染→脫色→復(fù)染)，脫色時(shí)間控制精準(zhǔn)。

　　- 免疫熒光染色：樣本需封閉(如BSA孵育)，一抗、二抗依次孵育，避光操作。

　　2. 標(biāo)記與記錄

　　- 標(biāo)記位置：用記號(hào)筆在磨砂面標(biāo)注樣本名稱、濃度、日期，避免接觸樣本面。

　　- 編號(hào)規(guī)則：采用“日期+樣本類型+編號(hào)”格式(如20231001-Blood-01)。

　　五、保存與常見(jiàn)問(wèn)題

　　1. 保存條件

　　- 短期保存：封片后置于干燥盒內(nèi)，避光防潮。

　　- 長(zhǎng)期保存：用封口膜包裹載玻片，存放于切片盒中，4℃或-20℃保存。

　　2. 常見(jiàn)問(wèn)題與解決

　　- 氣泡殘留：重新封片或用針頭挑破氣泡后補(bǔ)封片劑。

　　- 樣本過(guò)厚：可能導(dǎo)致顯微鏡調(diào)焦困難，需重新制備更薄樣本。

　　- 污染霉變：樣本發(fā)霉時(shí)用70%乙醇擦拭，重新固定封片。

　　- 蓋玻片碎裂：操作時(shí)避免用力不均，選用合適厚度的蓋玻片(通常18μm)。

　　六、特殊實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

　　1. 活細(xì)胞觀察：需使用恒溫載物臺(tái)(37℃)，封片劑選擇生理鹽水或?qū)Ｓ门囵B(yǎng)基。

　　2. 原位雜交(FISH)：載玻片需經(jīng)多聚賴氨酸處理以增強(qiáng)樣本附著力。

　　3. 電子顯微鏡樣本：需將樣本包埋于樹(shù)脂中，載玻片僅用于初步處理。